リグニン分解酵素遺伝子導入シロイヌナズナを用いたダイオキシン類のファイトレメディエーション(研究科分,平成15年度麻布大学公的研究助成金事業研究成果報告)

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近年,内分泌撹乱物質としてのダイオキシン類の環境汚染が社会問題となってきており,汚染の有効的な除去法として従来の方法より低コストのバイオレメディエーションが注目を集めている。そこで,本研究では,従来からダイオキシン類の生分解についての報告の多い白色腐朽菌の産生するリグニン分解系酵素に着目し,これらの酵素群をコードする遺伝子を導入したトランスジェニックシロイヌナズナを作成するためのクローニングに取り組んだ。リグニン分解酵素群の中でも有害汚染物質の分解に関する報告の多い,リグニンペルオキシダーゼ(LiP),マンガンペルオキシダーゼ(MnP),ラッカーゼ(Lac)の3種類の酵素をコードする遺伝子に着目し,そのクローニングを行った。まず,これまでに報告のあったリグニン分解酵素群をコードするcDNAの塩基配列を参考に,数種類のプライマーを作製し,白色腐朽菌,P. chrysosporium(UAMH3641)およびT. versicolor(UAMH 8272)のcDNAをテンプレートとしてRT-PCR法を行い,数種類の増幅産物を得た。これらの増幅産物のcDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーで解析し,得られた配列についてNCBI-BLASTのDNAライブラリで相同性の検索を行った。その結果,P. chrysosporiumのLiP及びMnP, T. versicolorのLacのそれぞれcDNA中に,ライブラリ中の配列と高い相同性を有するものが見い出された。そこで,バクテリオファージラムダと大腸菌ゲノム間の類似組み換え反応を応用した遺伝子クローニングシステム(Gateway Technology/Invitrogen)を用いて,LiP, MnPおよびLacをコードする完全長cDNAのクローニングを試みた結果,それぞれの完全長cDNAのクローンを得ることができた。これらのcDNAの塩基配列は,ライブラリ上の配列と95%以上の高い相同性を有していた。また,3種の完全長cDNAの塩基配列をアミノ酸に変換し,上述のライブラリの塩基配列を同じくアミノ酸に変換したものと比較したところ,97%以上の高い相同性を示した。しかし,今回同定したアミノ酸配列は,どのライブラリ配列とも数%の差が見られ,これらの結果からは,今回塩基配列を決定した3種類の酵素をコードするcDNAは,これまでに報告されている対象遺伝子の変異体である可能性が考えられた。さらに,LiPとMnPのアミノ酸配列中に約10アミノ酸残基からなる共通の配列が見られ,この配列部位がペルオキシダーゼとしての酵素活性に必要な触媒ドメイン,あるいは基質結合ドメインである可能性が示唆された。また,今回同定したLacは,他菌種由来のLacのアミノ酸配列との相同性も高かったことから,異菌種由来のLacタンパク質間で構造が類似していると考えられた。これらの遺伝子を,タンパク質発現用ベクターpDEST15に組換え反応し,大腸菌細胞中での酵素遺伝子の発現を試みた。その結果,LiP,MnPおよびLacについて,GST融合タンパク質として予想されるサイズのバンドをSDS-PAGEで確認することができた。さらに,植物形質転換用Tiプラスミドベクターであり,なおかつGatewayに対応したベクターpPDB-GBを作成した。
麻布大学の論文

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