ドライアイスを用いたマウス胚の二段階凍結法
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概要
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胚の新しい簡易凍結法を開発するために,この研究を行った.ドライアイスを用いた二段階凍結法で,マウス桑実胚を-196°Cに急速凍結した.すなわち,グリセリン添加胚の入った試験管を,植氷せずに0°Cからただちに魔法びん内の粉末ドライアイス中に移し,試験管の下部2/3をドライアイス中に埋没させた.このまま10〜15分間静置した後,サンプルを液体窒素へ浸漬して凍結を完了した.0°Cにおけるグリセリン平衡時間を0.1〜60分とすると,グリセリン濃度が1.5および1.8Mのときにはいずれも10分と30分の平衡で,2.5Mのときには10分の平衡で生存率が高かった.この凍結法では,グリセリンに保護効果が認められたが,エチレングリコール,DMSO, PVP,エリスリトール,ショ糖には保護効果はなかった.緩慢融解(0〜32%)より急速融解(58〜81%)で胚の高い生存率がえられ,凍結•融解胚からグリセリンを急速に除去するより,緩慢に除去した方が生存率が高かった.凍結•融解胚からグリセリンを緩慢に除去すると,ドライアイス凍結法によって従来の緩慢凍結法(85%)と同等の高い生存率(81%)がえられた.この方法で胚を凍結した後に培養で発生した胚盤胞を宿主に移植して,子どもが生まれた.これらの成績から,ドライアイスによる簡易急速凍結法は,哺乳類胚の凍結法に適用できると思われる.
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