動物細胞抽出液のDNA合成酵素の測定について
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概要
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Concerning the estimation of DNA synthesizing enzyme (DNA nucleotidyltransferase, DNA polymerase) in extracts of animal cells, some problems in preparation of cell extracts and estimation of their enzymatic activities were investigated. (1) HeLa cells were disrupted by osmotic shock and centrifuged with or without addition of KCl at 0.05 M. Although the concentration of salts in the final extracts was adjusted to be the same, higher activiy of DNA nucleotidyltransferase and DNase in both specific and total activities was estimated in the extract with KCl, suggesting that KCl protects the activity. (2) Activities of DNA nucleotidyltransferase and DNase were compared in extracts of HeLa cells prepared after disruption of cells by osmotic shock or 20 KC sonic treatment. By osmotic disruption, the extract of higher specific activity of DNA nucleotidyltransferase and lower one of DNase were obtained. However, the extract after sonication contained higher total activities of both enzymes. (3) Similar effect of KCl and sonic treatment in preparing cell extract was also established from Landschutz ascites tumor cells. (4) The cell extract was obtained by centrifuging the disrupted cell suspension of small amount of HeLa cell at 105,000 × g for 15 or 30 minutes, contrary to the common condition of centrifugation at 105,000 × g for 60 to 90 minutes. (5) From HeLa cells, the extracts of cell nuclei, small particles and cell sap were prepared after osmotic shock followed by differential centrifugation at isotonic sucrose concentration and sonic treatment. It was found that most of both enzymes were contained in cell sap and the lowest activities were estimated in cell nuclei. (6) The extracts of HeLa cells or ascies tumor cells were precipitated at pH 4.8 with 0.2 N acetic acid and enzyme solution of higher DNA nucleotidyltransferase activity was usually prepared. However, DNase activity was decreased by acid precipitation. (7) DNA nucleotidyltransferase of HeLa cell, especially in cell nuclei, was activated after infection with herpes simplex virus. Similar slight activation after virus infection was observed in DNase too. In addition, activating ratios varied depending on time after infection. (8) Enzyme solution was adsorbed on small pieces of filter paper and the estimation of DNA nucleotidyltransferase with the enzyme-paper was discussed. Linear incorporation of TMP was observed for 3 hours, although the activity was decreased by adsorbing the enzyme on paper and by drying it. However, the activity of DNA nucleotidyltransferase was more or less inhibited by crushed cyanogum gel, but not by non-crushed one.動物細胞抽出液のDNA合成酵素の測定について特に抽出液の調製および活性測定に関する若干の問題点をHeLa細胞ならびにLandschutz腹水癌細胞を用いて検討した. (1) HeLa細胞を滲透圧ショックで破壊して抽出液を調製する場合低濃度のKCl-K^+-PO_4の添加は活性の保護に有効であつてDNA合成酵素およびDNase活性の高い抽出液が得られた. (2) HeLa細胞の破壊について滲透圧ショックと音波処理とを比較した.この結果前者によつてDNA合成酵素の比活性が高くDNaseのものは低い抽出液が得られた.しかし全酵素活性の抽出効果は音波処理がすぐれていた. (3) 細胞抽出液の調製における塩濃度の効果および音波処理の影響についてはLandschutz腹水癌細胞でもHeLa細胞の場合と類似の結果が認められた. (4) 少量の細胞からの抽出に際しては遠心分離時間を短縮することは支障ないことが認められた. (5) 滲透圧ショック,蔗糖等張濃度での分別遠心分離および音波処理によつてHeLa細胞から,細胞核,小粒子および細胞液各成分の抽出液を調製しその活性を測定した.大部分のDNA合成酵素およびDNase活性は細胞液に含まれており次いで小粒子,細胞核の順であつた. (6) HeLa細胞および腹水癌細胞の抽出液からpH4.8で沈澱させ一般に比活性の高いDNA合成酵素液を調製することが出来た.しかしDNaseの活性は著しく低下した. (7) HeLa細胞のDNA合成酵素はherpes simplexウイルスの感染によつて活性化され特に細胞核で顕著であつた.類似の活性化はDNaseでも認められた,さらにこれらの活性化はウイルス感染後の時間によつてかなり変動し,感染後3時間より増大した. (8) 酵素を吸着した濾紙片でもDNA合成酵素の活性を測定することは出来たが,活性の低下は免れなかつた.この活性の低下は吸着後の乾燥によつて増加したが,吸着助剤としてのアルブミンの添加や酵素の使用量を増すことによつて多少抑制された. (9) Cyanogumgel小片はDNA合成酵素活性に対しては殆ど阻害作用を及ぼさなかつたが,gelを砕くと若干の活性低下が認められた.
- 九州大学の論文
- 1965-05-00
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