P-14 質量分析法による膜タンパク質のトポロジー解析 : クロスリンカーを用いたCytochrome P450 17α-Cytochrome b_5複合体の構造解析(ポスター発表の部)
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概要
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Cytochrome P450s in endoplasmic reticulum membranes function in the hydroxylation of exogenous and endogenous hydrophobic substrates concentrated in the membranes. The reactions require electron supplies from Cytochrome b_5(Cyt b5) and NADPH-Ctochrome P450 reductase in the same membranes. We have analyzed the membrane topology of cytochrome P450 17α(CYP17) using chemical modifications and mass spectrometry. In this study, we analyze membrane topology of CYP17 and CYP17-Cyt b5 complex by using of crosslinker. Recombinant CYP17 (guinea pig) and Cyt b5 (human) were isolated from Escherichia coli. CYP17 was incorporated into phosphatidylcholine-phosphatidylserine liposome at a lipid by cholate dialysis procedures. And the water-soluble crosslinker(BS^2, BS^3, BS^4) were crosslinked between Lysine residues in CYP17 and the amino group of phosphatidylserines. The modified samples were digested by trypsin, and the molecular weights of the peptide fragments were determined by MALDI-TOF mass spectrometry. From the increase in the molecular weights of the peptides, the positions of modifications were determined at Lys54, 57, 226, 480 and 489. From this result, we could expect the membrane topology of CYP17 in liposome. CYP17-Cyt b5 were incorporated into phosphatidylcholine liposome by the same way. And crosslinked by BS^4 between Lysine residues of CYP17 and Cyt b5. The result of SDS-PAGE of reaction solution, a band appeared at 70kDa. In gel digestion of this band by trypsin, and the molecular weights of the peptide fragments were determined by MALDI-TOF mass spectrometry. From the Peptide Mass Fingerprinting, we could identify this band is CYP17 and Cyt b5. And from the increase in the molecular weights of the peptides, the positions of modifications were determined. It was found that the reagent crosslinked CYP17 and Cyt b5 at positions of Lys247(CYP17) and Lys18(Cyt b5), 289(CYP17) and 23(Cyt b5), 244(CYP17) and 32(Cyt b5). From this result, we could expect the topology of CYP17-Cyt b5 complex in liposome.
- 天然有機化合物討論会の論文
- 2005-09-15
著者
-
小南 思郎
広大院・総合科学
-
平田 敏文
広島大理
-
山崎 岳
広島大学総合科学部
-
平田 敏文
広島大院理
-
泉 俊輔
広島大学大学院理学研究科数理分子生命理学専攻
-
泉 俊輔
広島大学
-
泉 俊輔
広島大院理
-
泉 俊輔
広大院理
-
山崎 岳
広島大総科
-
水野 初
広島大学大学院理学研究科数理分子生命理学専攻
-
山崎 岳
広島大 総合科学
-
水野 初
広島大院理
-
小南 思郎
広島大総科
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