25 ホスホリパーゼA_2触媒抗体の作成とその反応性(口頭発表の部)
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概要
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Phospholipase A_2 (PLA_2), rate-determining enzyme in arachidonic acid cascade, is not only one of the most important hydrolytic enzymes of phospholipids in cell membranes, but also causes cell fusion by the production of high concentrated lisophospholipids. Monoclonal antibody was generally produced by cell culture's method. We investigated the preparation of PLA_2 antibodies, influence against cell membranes, by designed racemic hapten 1 and its structural recognition of several substrates. Hapten 1, synthesized in twelve steps from solketal, was conjugated directly to the carrier protein keyhole limpet hemocyanin (KLH) with water soluble carbodiimide (WSC). Fifty monoclonal antibodies specific for hapten 1 were generated using standard protocols and purified from ascites by protein G affinity chromatography. Homogeneous of each antibody was determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Hydrolytic reaction of substrate 7 was assayed in 50mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) at 37℃ by enzymatic colorimetric manner for determination of free fatty acid. Twenty-two antibodies were found to accelerate the hydrolytic degradation of 7 to free fatty acid compare with those of uncatalyzed reaction, and the most effective antibody 7B3 was characterized in further detail. The kinetic parameters of 7B3 from Lineweaver-burk plot were afforded values of Km=347μM, Vmax=2.52μM/min and kcat=0.063min^<-1>, respectively. Moreover hydrolytic activity of 7B3 against several substrates was studied for the determination of structural recognition. Substrate 6 (C_1=C_2=C16), 8 (C_1=C10, C_2=C16), and 9 (C_1=C16, C_2=C10) was not hydrolyzed by 7B3. Further hydrolytic activity of 7B3 against substrate 10, replaced choline ammonium group of 7 to bromine, was reduced to about half times. Therefore antibody 7B3 recognized not only the side chains at C_1 and C_2, but also the choline ammonium group in substrate, respectively. From above results, hydrolytic mechanism of 7B3, phospholipase A_2 antibody, was found to occur the efficient three parts recognitions of substrate by catalytic antibody.
- 天然有機化合物討論会の論文
- 1995-09-01
著者
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