Locked nucleic acid（LNA）を利用した高性能ハイブリダイゼーションプローブの作製
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概要
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高度に保存された塩基配列を有するmRNAのin situ hybridization（ISH）による特異的検出を目的として、locked nucleic acid（LNA）を利用したキメラオリゴヌクレオチドプローブを作製し、その実用性を評価した。塩基配列で90％以上の相同性を示すカブのニトリラーゼアイソフォームBrNIT-T1及びBrNIT-T2との間で相同性の低い24〜25塩基の領域に相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、両者間で異なる塩基（9〜10塩基）をLNAに置換したLNA-DNAキメラオリゴヌクレオチドを作製した。配列中にLNAを部分的に導入することにより、DNAのみでは55〜57℃であったオリゴヌクレオチドのTm値は78〜82℃に上昇し、ISH解析に十分な値を示した。BrNIT-T1及び、BrNIT-T2の全長転写産物に対する結合性をドットブロットノザンハイブリダイゼーションにより調査したところ、BrNIT-T1及びBrNIT-T2のそれぞれの配列に対応するLNA-DNAキメラプローブは互いの転写産物に非特異的に結合することなく、目的の転写産物のみを検出できることが確認された。さらにこれらのキメラプローブをカブ根こぶ病組織のISH解析に応用し、従来のcRNAプローブを用いた解析では得られなかった、BrNIT-T1とBrNIT-T2の時空間的な発現特異性を明らかにすることに成功した。
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