Prevotella intermedia由来リコンビナントDnaKタンパクの作製
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概要
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これまでに歯周炎病巣から分離したPrevotella intermedia(P.intermedia)が菌体外多糖を産生してバイオフィルムを形成する際,熱ショックタンパクの1つであるDnaK遺伝子転写レベルが上昇していることを報告してきた.近年の研究で,細菌由来のDnaKは宿主細胞に対する様々な生物学的活性をもった分子として働いていることも明らかにされつつある.本研究では,P. intermedia DnaKのバイオフィルム形成における役割と,宿主免疫に与える影響をさらに検討するため,リコンビナント化と特異抗体の作製を試みた.供試菌には既に全ゲノム配列が明らかにされているP.intermedia strain 17(strain 17)を用いた.データベース上の配列をもとに,strain 17のゲノムDNAをテンプレートとしてDnaK遺伝子のPCR増幅を行い,得られたPCR産物をTOPO cloning vectorに挿入し,配列がデータベース上のdnaKと相同であることをシークエンシングにより確認した.得られたDnaK遺伝子DNAをタンパク発現ベクターpETにligationし,目的遺伝子を含むpDAKを作製した.10ngのpDAKを50μLのコンピテント化したEscherichia coli(E.coli) BL21(DE3) pLysSに加え,通法に従い熱ショックにより形質転換した.目的タンパクの発現はSDSゲル電気泳動とN末端アミノ酸シークエンス分析によって確認した.得られた精製リコンビナントDnaKタンパクを免疫原として家兎ポリクローナル抗体を作製した.抗体価の上昇はリコンビナントタンパクとELISA法にて確認した.Strain 17のdnaK ORFを挿入したpDAKにより形質転換したE.coli BL21(DE3)pLysSの培養菌液をSDSゲル電気泳動したところ,分子量70kD付近に目的タンパクの発現を認め,N末端10残基の配列はstrain 17 DnaKと相同であった.家兎にリコンビナントDnaKを免疫して得られた抗体と,超音波破砕したstrain 17の菌体,培養上清ならびにリコンビナントタンパクを用いてウエスタンブロッティングを行ったところ,70kD 付近に特異的なバンドが認められた.今回の結果から,strain 17のdnaK ORFを基に得られたリコンビナントタンパクはDnaKと相同であること,これを免疫原として得られた抗体はwild-typeのP.intermedia DnaKを認識していることが示唆された.
- 大阪歯科学会の論文
- 2011-09-25
著者
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