Nonradioactive Digoxigenin-labeled DNA Probes for the Detection of Five RNA Species Present in Beet Necrotic Yellow Vein Virus
スポンサーリンク
概要
- 論文の詳細を見る
テンサイそう根ウイルス（Beet nectotic yellow vien virus,BNYVV）に含まれる5種類のRNAのcDNAをクローニングした。得られたcDNAクローンのサイズは次の通りであった：RNA－1、3.0kbp；RNA－2、1.7kbp；RNA-3、1.8kbp；RNA－4、1.5kbp；RNA－5、1.4kbp。RNA-1とRNA-2由来のcDNAクローンは、それぞれ全ゲノムの3’末端側45％と35％を占めていた。RNA-3、RNA－4およびRNA－5からのcDNAクローンはほぼ全長であった。各cDNAクローンをジゴキシゲニン標識し、Northern blot hybridization でウイルスRNAの検出条件を検討した結果、試料はホルマリン・ホルムアルデミド変性、プローブのソニケーション、プローブ量は50ng/ml,ホルムアミド存在下の温度は42℃で行うのが最適であった。BNYVVの4～5種のRNAを検出するためには、全RNA量として1～10ngが適当であった。全RNA量が20ng以上では、RNA-3、RNA-4およびRNA-5の間でお互いにわずかに反応が認められた。この原因は、プローブの3’末端にみられる共通配列によることが確かめられた。Dot blot hybridization によるウイルスRNAの検出感度は、10pgであったが、試料の濃度が高くなるにつれて、RNA-3、RNA-4およびRNA-5の間でお互いに反応が認められた。各種BNYVV分離株を用いて、それらに存在するRNA組成とサイズをNorthern blot hybridization により解析したところ、検定植物ツルナ接種葉の場合には、直接全核酸を調整した試料からウイルスRNAの検出が可能であったが、Polymyxa betae 菌で接種されたテンサイの根の場合には、ウイルス濃度に応じて部分純化または濃縮した試料から核酸を調整する必要があった。このような条件下で、ほ場および室内分離株に存在するBNYVV RNA種およびそれらの欠失変異株を確実に検出することができた。Complementary DNA (cDNA) clones corresponding to each of five distinct RNA species of beet necrotic yellow vein (BNYVV) were synthesized and identified. The sizes of each cDNA clone for RNAs 1,2,3,4 and 5 molecules were 3.0, 1.7, 1.8, 1.5 and 1.4 kbp, respectively. cDNA inserts to RNA 2 were covered at a part of the 3'regions, and those of RNAs 3,4 and 5 were almost full-length. The plasmids containing each of cDNA inserts were labeled with digoxigenin by the random priming method. Northern blot hybridization tests showed that individual probes hybridized specially to each of the five RNAs. Good results were obtained with 1 to 10 ng of RNA as a mixture of five RANs, but the probe to RNA 3, RNA 4 or RNA 5 gave a weak signal with hererologous RNAs when more than 10 ng RNA was used. In dot blot hybridization, the limit of detection was about 10 pg RNA, but if a higher content of RNA was spotted, cross reaction occurred using heterologous RNAs. For laboratory and field isolates of BNYVV, each of RNAs 3,4 and 5 was easily detected by Northern blot hybridization in total nucleic acids extracted from Tetragonia expansa leaves inoculated mechanically, but not from roots of sugar-beet plants inoculated by the fungus Polymyxa betae. However, satisfactory results were obtained with partially purified or concentrated preparations from roots. These findings indicate that the digoxigenin-labeled probes are useful for the identification and detection of RNAs contained in field and laboratory isolates of BNYVV.
- 岡山大学資源生物科学研究所の論文
著者
関連論文
- (399)Benyvirusのコードするシステインリッチタンパク質のRNAサイレンシングサプレッサー活性(平成16年度日本植物病理学会大会講演要旨)
- (286) 土壌伝染性ウイルスのシステインリッチタンパク質は根のRNAサイレンシングを抑制する(平成20年度日本植物病理学会大会講演要旨)
- (266) ランえそ斑紋ウイルス(OFV)様粒子の核内での形態形成とViroplasm様構造の関連性(平成20年度日本植物病理学会大会講演要旨)
- (32)BNYVV 54 kDA : 読み過ごし領域導入植物のウイルス抵抗性を打破するBNYVV欠失変異株の出現(関西部会講演要旨,平成19年度地域部会講演要旨)
- (31)ランえそ斑紋ウイルス構造タンパク質Mの病原性はヌクレオキャプシドタンパク質Nにより抑制される(関西部会講演要旨,平成19年度地域部会講演要旨)
- (236) Beet necrotic yellow vein virus p31の根特異的サイレンシング抑制効果(平成19年度日本植物病理学会大会講演要旨)
- (235) 土壌伝染性ウイルスBNYVVおよびTRVは根において特異的にRNAサイレンシングを抑制する(平成19年度日本植物病理学会大会講演要旨)
- (227) テンサイ接種葉におけるBeet necrotic yellow vein virus抵抗性の病理学的および遺伝学的特性(平成19年度日本植物病理学会大会講演要旨)
- ランえそ斑紋ウイルス(OFV)がコードするORF3タンパク質の機能解析(関西部会講演要旨,平成18年度地域部会講演要旨)
- (368) Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV)感染植物の葉と根におけるRNAサイレンシング活性の比較(平成18年度日本植物病理学会大会講演要旨)