2種類の蛍光誘導体化試薬を用いた血清及び尿中ヒドロキシプロリン及びプロリンの液体クロマトグラフィーによる同時定量
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概要
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2種の蛍光誘導体化試薬を用いた液体クロマトグラフィー(LC)による血清中Free及び尿中Totalのヒドロキシプロリン(Hyp)及びプロリン(Pro)の同時定量法を開発した。血清中のHyp及びProはo-フタルアルデヒドによる処理後に4-(2-フタルイミジニル)フェニルスルポニルクロライド(Phisyl-Cl)で蛍光誘導体に導いた。加水分解尿中のイミノ酸はo-フタルアルデヒド及びBond Elut C18カラムによる処理後に4-(5,6-ジメトキシ-2-フタルイミジニル)フェニルスルホニルクロライド(DPS-Cl)で蛍光誘導体に導いた。この二つの反応液を混合し、過剰の試薬を除去するためにジクロロメタン抽出を行い、得られる水層(10μl)をLCに注入した。イミノ酸のPhisyl及びDPS誘導体はいずれもEx300nm及びEm400nmにおける蛍光検出でアセトニトリル/リン酸塩緩衝液(5mM,pH2.5)を用いたグラジエント溶出法により逆相系カラムで分離検出された。Hyp及びProの検出限界(S/N=3)は注入量あたりPhisyl誘導体でそれぞれ30及び40fmol、DPS誘導体ではいずれも5fmolであった。日内及び日差の精度(R.S.D.)は血清及び尿中Hyp及びProのいずれにおいても2.77%以下であった。血清及び尿に添加したHyp及びProの回収率は97.6〜103.6%であった。本法は高感度で精度が高いことから、血清及び尿中Hyp及びProの同時定量に有用である。
- 福山大学の論文
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