3. 凍結及び乾燥によるバクテリオファージの保存の実際(セミナー「凍結及び乾燥による微生物株保存の実際」の講演並びに討論要旨)
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概要
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バクテリオブァージの保存は,細菌やカビなどに比べるとむしろ容易であるといえる.それはファージ粒子はその増殖のために必要なmachinaryをすべて宿主である細菌に依存しているため,宿主菌体内でしか増殖できず,一旦成熟したファージ粒子となって菌体外に出ると,それ自身は代謝活性を持たず,低温に保持するだけでかなり安定に保持できるからである.ファージを保存するためには,まず力価の高いファージ懸濁液を作らねばならない.それには大きく分けて二つの方法がある.一つは液体培養による方法で,対数増殖期の細菌にほぼ同数のファージ粒子を加え,よく通気しながらさらに培養を続けると,ファージが増殖して最終10^<10>/ml程度の力価のものを得ることができる,これを低速の遠心沈殿をして溶け残った細菌を除き,さらに上澄のファージ液中の細菌を殺菌すればファージ懸濁液を得ることができる.いま一つの方法は軟寒天培地中で増殖させる方法である.これは寒天平板培地上に宿主の細菌,ファージ,それに0.7%の軟寒天培地5mlを混ぜたものを流して固めた後,一晩培養すると最初に混ぜたファージが10^5〜10^4/plateの濃度の所では平板全体に溶菌斑(プラーク)が拡がる.但しプラークの大きいファージの場合には10^3〜10^2/plateの濃度でよい.ここに少量の液体培地を加えて10分から20分放置し,ファージをこれに懸濁させると10^<10>/ml程度の力価のものをとることができる.この場合も溶け残りの細菌は遠心沈殿で除き,上澄を集めて適当な方法で殺菌すればよい.細菌を取り除く方法としては,バクテリアフィルターで炉過する方法,細菌とファージの熱に対する耐性の差を利用して,60℃,30分程度の熱処理をする方法,クロロホルムを加えて振盪して細菌だけを殺菌する方法などがあるが,いずれの方法でも前もって条件の検討をしておく必要がある.このようにして調製したファージ懸濁液は,無菌テスト,力価の測定をした後次の各保存法で保存すればよい.
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