新規アミノ酸アンモニアリアーゼのスクリーニング

概要

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微生物酵素の新しい機能開発の研究の一環として,カルボキシル基末端が保護されたマレイン酸およびフマル酸誘導体に対し,不斉マイケル反応的にアンモニアを付加し,α-カルボキシル基末端が保護されたL-アスパラギン酸誘導体の合成を触媒する新規アンモニアリアーゼのスクリーニングについて検討した。この酵素を自然界および保存菌株に検索したが,目的の酵素は得られなかった。しかしながら以下に示すいくつかの新しい知見を得た。まず,基質としてN-マレイル-3-アミノペンタン,N-マレイル-L-フェニルアラニノール,N-フマリル-3-アミノペンタン,L-アスパラギン酸-α-(1-エチルプロピル)アミド,L-アスパラギン酸-α-(L-1-ハイドロキシメチル-2-フェニルエチル)アミドをそれぞれ数グラムスケールで合成した。これら合成基質の資化菌を様々な手法を用いて自然界より求めた。目的とするアンモニアリアーゼ生産菌を見いだすことはできなかったが,アミド結合を加水分解する菌株を単離できた。次にN-マレイル-L-フェニルアラニンメチルエステルを基質として,保存菌株中からL-アスパルチル-L-フェニルアラニンメチルエステルを与える新規アンモニアリアーゼのスクリーニングを行った。基質のエステル部分を加水分解する副反応が優先するため,目的の反応を触媒する株は見出せなかったが,真核生物では酵母よりもかび,原核生物ではグラム陰性細菌よりもグラム陽性細菌が頻度高くエステル加水分解酵素活性を示した。さらに,自然界よりアスパラギン酸を単一炭・窒素源として生育できる微生物を分離し,アスパルターゼ活性産生株をスクリーニングした。その結果アスパラギン酸資化菌として得られた細菌の約9割がアスパルターゼ活性を有していることがわかり,アスパルターゼ産生株の有効的なスクリーニング法を確立することができた。分離したアスパルターゼ活性高生産株12株を同定した結果,腸内細菌群に属する2菌をEnterobacter agglomerans,ブドウ糖非発酵性グラム陰性細菌群に属する10菌のうち6株をPseudomonas fluorescens,4株をP. putidaと同定した。
富山県立大学の論文

新規アミノ酸アンモニアリアーゼのスクリーニング

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