<所内学術研究成果報告>T. シロイヌナズナ花粉母細胞の減数分裂時の染色体に対する FISH 法の確立

概要

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染色体を個別に追跡しその挙動を調べることのできる方法,FISH法をシロイヌナズナの花粉母細胞の減数分裂時の染色体に適用することを目的に条件検討を行った。その結果,以下の条件でFISHを行うのが最良と結論された。花序の固定はカルノイ溶液(75%エタノール,25%酢酸)を用い,室温で16時間程度行う。細胞壁とカロース層の消化は0.4%Cellulase,0.4%Pectolyase,0.4%Cytohelicase,1370U/ml β-Glucronidaseを用いて37℃で3時間処理する。スライドガラス上に消化した細胞を展開した後,再度カルノイ溶液で固定する。0.1mg/ml RNaseAで37℃30分間,0.0025%ペプシンで37℃3分間,4%パラフォルムアルデヒドで室温10分間処理した後,エタノールシリーズを通し風乾させる。ビオチン標識したプローブDNAとスライドガラス上の染色体DNAと同時に72℃3分間熱変性させた後,37℃16時間反応させハイブリッドを形成させる。洗浄後,アビジン-FITCを反応させ,ビオチン化抗アビジンDを用いて,シグナルの増幅を行う。なお,本研究においてはBACクローンF10B6よりプローブを作成し用いた。