Bacillus circulans G22-10由来環状イソマルトオリゴ糖合成酵素(CITase)遺伝子のクローニングと大腸菌発現系の作成

概要

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Bacillus circulans G22-10由来環状イソマルトオリゴ糖合成酵素(CITase)の大量調製を目的として、同酵素遺伝子のクローニングと大腸菌を宿主とする高発現系の構築を試みた。 B. circulans G22-10のゲノムからPCR法により増幅したCITase遺伝子を、pET-15bのNdeI-BamHIサイトに組込み、同遺伝子クローニングベクターpCITを構築した。pCITを用いて発現用宿主E.coliBL21(DE3)pLysSを形質変換し、CITaseを生産するBL21(pCIT)を得た。BL21(pCIT)をインスタントTB培地で培養することで、著量のCITaseが菌体内に可溶性タンパク質として発現された。菌体を破砕し粗酵素液を調製後、Ni-NTA アガロースカラムクロマトグラフィーで精製した。精製酵素はSDS-PAGEでシングルバンドとして検出され、ザイモグラフィーの酵素活性と一致した。大腸菌組換え型CITaseとG22-10由来の非組換え型CITaseの諸性質を検討したところ、至適温度、至適ph、温度安定性、ph安定性は同様であった。また、デキストランを基質としたときの生産物特異性についても、同様であった。大腸菌組換え型にはN-末端に21アミノ酸の付加配列が存在するが、酵素の性質には全く影響がないと結論した。
2007-03-20