Candida albicans由来のオキシドスクアレン-ラノステロール環化酵素の大腸菌における発現について
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概要
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古くから、オキシドスクアレン-ラノステロール環化酵素(OLC)の研究が成されてきているが、酵素アミノ酸残基レベルでの触媒機構こついては不明な点が数多く残されたままである。その解明には、異種細胞での高発現系の構築が必須であり、当面の課題となってきている。我々は、大腸菌におけるCandida albicans由来OLCの高発現系の構築を目的として実験を行った。まず、天然型のOLCを大腸菌で発現させた。しかし、不溶性であり、酵素活性も検出できなかった。次に、他の酵素の研究における可溶化の成功例やスクアレンーホペン環化酵素の研究を通して得た知見を参考にして、 TrxまたはDsb融合型、 N末端削除型、 QWモチーフ改変型の合計9種頬のOLCを大腸菌で発現させてみた。しかし、不溶性のままであり、酵素活性も検出できなかった。様々な方法によってOLCを大腸菌で発現させたにも関わらず、不溶性の問題を解決できなかったことから、 OLCの発現宿主には酵母や昆虫細胞などの真核生物を利用する必要があることが示唆された。In order to investigate the catalytic mechanism of oxidosqualene-lanosterol cyclase (OLC), we have tried to construct the overexpression system of OLC from C. albicans in E. colt. First, a natural type of OLC was expressed in E.coli. However, it was insoluble in E.coli cell and had no enzymatic activity. Therefore, nine kind of altered OLCs were constructed on the basis of successful methods for other enzymes to increase the solubility or the suggestion from our experimental results for the squalene-hopene cyclase: a fused OLC with Trx or Dsb, a OLC deleted N-terminal domain and mutant OLCs having squalene-hopene cyclase types of QW motif. However, all types of OLC were insoluble and had no enzymatic activity. These results suggested that the expression host of OLC must be eucaryotic cells such as yeast and insect.
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