Halobacterium halobium 由来のα様DNA polymerase : 新しい精製方法について
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概要
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高度好塩性微生物であるHalobacterium halobiumに由来するalpha様DNAポリメラーゼの新しい調整方法を考案した。核酸及び核酸結合蛋白質を分離するため細胞の破砕液に2％ポリエチレンイミン（PEI）を添加後，3MKClで酵素を抽出した。この粗酵素液に0．1％トリトンX－100を加え，PEI－セルロース樹脂と混合し，浴液中のKCl濃度を1Mまで希釈して酵素を樹脂に吸着させた後，酵素を3MKClで溶出した。次いでCM－セルロース樹脂，ヘパリンアガロース樹脂によるカラムクロマトグラフィーを行い，更に10％から30％のグリセリン密度勾配遠心分離法により精製を進めた。得た精製酵素はプリマーゼ活性を含んでおり，アフィデイコリンに感受性，ddTTPに非感受性を示した。SDS－ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法で構成蛋白質成分を調べると本酵素は70Kと62Kの2つのサブユニットから構成されており，既報告の結果と一致していた。以上のことより，今回調整した酵素がalpha様DNAポリメラーゼであることが確認された。この精製方法では，本酵素のほかRNAポリメラーゼの調整も可能であり，従来の方法より優れているといえる。This study is an attempt to find the new purification method for the a-like DNA polymerase from Halobacterium halobium.After the cells broken by a Potter homogenizer and removed cell debris,polyethyleneimine(PEI)was added to a final concentrantion of 2%(wtwt)into cell extract.Crude enzyme was obtained by 3M KCl extraction.Triton X 100 was added at concentration of 0.1% and then powder of PEI-cellulose resin was mixed with this enzyme fraction.To obtained 1 M KCl concentration,butter solution without KCl was added for enzyme fraction containing PEI-celluolose resin,and packed into the column.Enzyme was eluted by a linear gradient of KCl 1 to 3 M.The futher purification of enzyme was carried out the heparin-agarose column chromatography and the sedimentation of glycerol gradient.Purified enzyme was sensitive to aphidicolin and insensitive to ddTTP.The primase activity was detected in purified enzyme.SDSpolyacrylamide gel electrophoresis shows that this enzyme is composed of 70 K and 62 K subunits.These characters are good agreement with those of a-like DNA polymerse of the same organism previously reported.
- 大阪教育大学の論文
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