ムラサキイガイ足糸前牽引筋におけるイガイ抑制性ペプチドについての研究
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概要
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第1章序論 筋や分泌腺など効果器の活動は神経系によって支配されている。神経はさまざまな情報伝達物質をその末端から放出して効果器に働きかけ,その活動を適切に調節している。このような効果器調節に関与する神経情報伝達物質のうち,近年注目を集めているのは神経ペプチドである。構造的に無数の可能性があるペプチド性伝達物質は,効果器の微妙な活動調節に大きく寄与するものと想像されている。しかし,これまでに様々な動物から膨大な数のペプチドが単離されているわりに,特定の効果器の活動に対するペプチド性神経支配について体系立った研究はそれほどなされていない。そこで,本研究では軟体動物二枚貝の1種,ムラサキイガイMytilus edulisの足糸前牽引筋(anterior byssus retractor muscle, ABRM)を実験系として,筋運動を制御する抑制性神経ペプチドについての研究を行った。ABRMは典型的なキャッチ筋で,その運動は主としてアセチルコリン作動性の興奮神経とセロトニン作動性の弛緩神経の支配を受けていることが明らかにされている。これらに加えてペプチド性神経が存在する可能性が示唆されたのは,ABRMの主たる支配中枢である足神経節から3種類のペプチドが単離されたことによる。このうち2種類は,Gly-Ser-Pro-Met-Phe-Val-amideとGly-Ala-Pro-Met-Phe-Val-amideという相同性の高い構造のペプチドで,それまで知られる中で唯一,ABRMの収縮に対して強い抑制効果を示す物質であった。これらはイガイ抑制性ペプチド(Mytilus inhibitory peptides, MIPs)と名付けられ,2つの同族体はそれぞれS^2-MIP, A^2-MIPと呼ばれた。これらは足神経節から単離され,筋に投与すると収縮抑制効果を示すことから,ABRMにおいて生理的に機能する神経ペプチドであることが期待されてきた。しかし,これを支持する生理学的証拠はない。本研究では,ABRMにおいてMIPsを伝達物質として用いる抑制性[table]神経支配が存在することを証明することを目的とした。第2章ABRMに含まれるMIPsの単離,構造決定と活性の解析 ペプチド性伝達物質は神経節にあるニューロン細胞体で生合成され,軸索を通って標的器官の近傍へと輸送され,神経末端部の分泌小胞の中に蓄えられている。そして神経の電気的興奮に応じて放出され,標的器官上の受容体へ作用する。従って,足神経節から単離されたMIPsがABRMを制御する神経ペプチドであるなら,ABRMの表面や内部に分布する神経要素にも存在するはずである。そこでABRMに含まれるMIPsの単離,同定を試みた。ムラサキイガイ10,000個体分のABRMのアセトン抽出物を,C18逆相系のオープンカートリッジにかけて粗精製した後,Sephadex G-15カラムでゲルろ過した。得られた画分について,ABRMの単離標本の収縮に対する効果を調べ,抑制効果をもつ画分を回収した。これをさらに数段階の逆相及びイオン交換HPLCで精製し,最終的に7種類の抑制性ペプチドを単離することができた。構造分析の結果,すべてC末端に-Pro-Xaa-Phe/Ile-amideを共通してもつMIPファミリーペプチドであることがわかった(図1)。7種のMIPsのうち,MIP_1, MIP_2は足神経節から単離されていたS^2-MIP, A^2-MIPと同一で,残りの5種類は新型のものであった。これら7種のMIPsのABRMの収縮に対する効果を調べた。すべてのペプチドが電気刺激による一過性収縮を10^<-10>-10^<-8>Mを閾値濃度として濃度依存的に抑制した。しかし,効果の強さはペプチドによって異なっていた。7種のMIPsはまた,ABRMの主たる興奮性神経伝達物質であるアセチルコリンや軟体動物の代表的な神経ペプチドの一つであるFMRFamideの投与によって引き起こされるこの筋の収縮をも抑制した。一方,どのペプチドもキャッチ状態の筋に投与しても弛緩をもたらすことはなく,神経刺激によって引き起こした弛緩に対しても全く影響を及ぼさなかった。このように7種のMIPsはABRMに対して専ら抑制という質的に同一の効果を示した。さらに,合成フラグメントペプチドを用いた実験から,C末の保存領域であるPro-Xaa-Phe-Val/Ile-amideがこの収縮抑制効果の発現に重要であることがわかった。以上の結果は,ABRMには少なくとも7種のMIPsが存在し,それらはすべて共通のシナプス後受容体を介して抑制効果を発現している可能性を示唆するものである。第3章ABRMにおけるMIPsの局在と神経刺激による放出 ABRMのアセトン抽出物から単離した7種のMIPsが筋の表面や内部を走行する神経線維に含まれるものであり,さらに,神経の興奮に応じてそこから放出されうることを示す実験を行った。まず,[photograph]MIP_1をキャリア蛋白(KLH)に結合させたものを抗原とし,ウサギに免疫して抗血清を得た。抗血清はアフィニティ精製によって抗キャリア蛋白抗体を除去した後,酵素抗体法(ELISA)によってその特異性を定量的に検定した。
- 広島大学の論文
- 1997-12-28