コロイド金免疫電子顕微鏡法の条件についての検討 ： マウス嗅球における樹脂包埋後免疫細胞化学法によるGABA免疫染色

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概要

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• In order to obtain ultrastructural information about the localization of a particular structure or molecule, it is very important to apply immunocytochemistry at the electron microscopic （EM） level. We examined the staining condition of post-embedding immunogold labeling at the EM level, especially using anti-GABA immunocytochemistry on the mouse olfactory bulb. Post-embedding immunogold labeling consists of three steps; 1） etching of the EM sections by sodium metaperiodate, 2） incubation in primary antibody and 3） incubation in gold-labeled secondary antibody. Thus in the present study we focused our investigation on three factors; 1） the duration of etching, 2） the concentration （or dilution） of primary antibody and 3） the concentration of secondary antibody. We assessed the specificity of the immunostaining by counting the number of gold particles per area of the profiles of GABAergic granule cells and non-GABAergic mitral and/or tufted （MT） cells as a background labeling.Firstly, one-way ANOVA indicates that the duration of etching of the EM sections by sodium metaperiodate causes difference in labeling under the same incubation conditions. Secondly, after the optimal etching, we investigated the effects of dilution condition of the primary and the secondary antibodies on the specific and nonspecific labeling. Two-way ANOVA indicates that the dilutions of both primary and secondary antibodies cause the difference in the labeling densities. Then Ryan's method was used to assess the differences in the number of particles on the granule cells and background MT cells.By examining three factors we established the optimal conditions for post-embedding GABA immunocytochemistry which constantly gives a high specific labeling with a low background labeling.細胞の超微形態における構造や分子の局在，化学的性質を知るために免疫電子顕微鏡法は有用な方法である。主な免疫電子顕微鏡法の１つであるコロイド金粒子を標識物質とする樹脂包埋後法は，１）電子顕微鏡切片のエッチング，２）一次抗体反応，３）コロイド金粒子標識二次抗体反応から構成されている。本実験では重要なステップでありながら現在まで条件が未検討であった，１）エッチング時間，２）一次抗体と二次抗体の濃度について検討した。対象組織として，マウスの嗅球を用い，抗体としてはアミノ酪酸（GABA）抗体を用いた。染色性の効果を判定するために，まずGABA陽性の介在ニューロンである顆粒細胞とコントロールとしてGABA陰性の投射ニューロンである僧帽・房飾細胞を選び，それらの細胞上のコロイド金粒子数の密度を計測した。さらに一元配置法および二元配置法を用いて解析した。その結果，エッチング時間は金コロイド標識の数に影響を与えること，また最適なエッチング時間下で，一次抗体，二次抗体の濃度が免疫反応に影響を与えることが判明した。これらの検討の結果より，GABA抗体反応時の最適条件を確立することができた。

• 2005-10-05

著者

• 小坂 克子

  九大・医・保健

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