マウス角膜線維芽細胞由来の不死化培養細胞における培養下コラーゲン線維形成におけるlumicanの効果
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概要
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lumican, keratocanなどのケラタン硫酸プロテオグリカンは,胚発生期にコラーゲン線維形成を制御することにより,角膜の形態形成に重要な役割を担っている.我々はlumicanのN-末端にある高度に保存された37-CX_3CXCX_9C-53ドメインのコラーゲン線維形成における役割を調べるために,野生型(CX_3CXCX_9C)と変異型(CX_3SXCX_9C)各々を持つlumican cDNAをsite-specific mutagenesisを用いて作成し,発現ベクターに挿入した後,不死化マウス角膜線維芽細胞(MK/T-1細胞)に導入した.安定形質細胞は,zeocinの存在下で選択,クローン化された.それらの細胞は親細胞であるMK/T-1細胞に類似した樹枝状形態を維持していた.野生型と変異型lumicanのそれぞれの培養上澄を用いたwestern blotでは,c-Myc-tagとlumicanに対する抗体を用いて42kDaのlumicanタンパクを検出した.透過電子顕微鏡(TEM)による微細構造分析は,両細胞系ともin vitroで多層構造の実質を形成していたが,両者の細胞系のマトリックス集合体には違いが認められた.両者を比較すると,直交したコラーゲン線維を含む領域において,野生型がより密なマトリックスを構成し,変異型には線維の集合と構造に明らかなばらつきがあることが示された.これらの結果は,変異型はlumican構造の変化をきたし,野生型が関与するコラーゲン線維形成と角膜実質内のマトリックス集合体の形成が障害されていることを示唆している.
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