シスゴルジマーカーを用いた細胞内タンパク小胞輸送評価系の検討
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概要
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【目的】粗面小胞体(rER)にて作られたタンパクは，COPII小胞に包まれ，Golgi装置へと輸送される(COPII輸送)。COPII輸送の抑制はERストレスを誘導し細胞障害を導くことから，COPII輸送調節メカニズムの解明のためにCOPII輸送の評価系の確立は重要である。BrefeldinA(BFA)は可逆的にGolgi装置を断片化させ，cis-Golgi領域の一部はrERと融合する。BFAを除去するとrERと融合していたcis-GolgiタンパクはCOPII輸送によりGolgi領域へと輸送されcis-Golgi領域は回復する。そこでBFA洗浄除去後のcis-Golgi形態の回復の程度を評価することにより，COPII輸送の評価系の確立を試みた。【方法】ラット正常腎由来株化細胞NRK細胞に，30分間BFAを処置した。BFAを洗浄除去し通常培地で培養後，cis-GolgiマーカーであるGolgi58Kタンパクの抗体を用いた蛍光免疫染色を行った。cis-Golgi 領域の形態は4段階に分類し評価した。COPII輸送の抑制刺激としては，H89によるリン酸化抑制，mastoparan-7による三量体Gタンパク活性化，FIPIによるPLD阻害を用いた。【結果】BFA処置30分後にcis-Golgiの形態は完全に崩壊した。BFA洗浄除去後40分で，cis-Golgiの形態は回復した。BFA洗浄除去後にH89，mastoparan-7，FIPIを処置した結果，全ての刺激においてcis-Golgiの形態の回復は有意に抑制されていた。【結論】作用点の異なる様々なCOPII輸送抑制調節に対し，本実験系を評価に用いることが可能であると考えられた。既存のVSV-G変異株発現系を用いた実験系に比べ，操作が簡便である点で有用性が高いと考えられる。
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