好熱好酸性アーキア Sulfolobus tokodaii 由来シスタチオニン γ-シンターゼの精製及び性質検討
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概要
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好熱好酸性アーキア Sulfolobus tokodaii 由来シスタチオニンγﾝシンターゼ（stCGS）遺伝子を pET-11a に組み込み pET-stCGS を構築した．このベクターでE. coli Rosettaﾝgami（DE3）を形質転換し，本遺伝子を発現させ，精製及び性質検討を行った．大腸菌で発現したシスタチオニンγﾝシンターゼの活性が無細胞抽出液で確認できた．S. tokodaii シスタチオニンγﾝシンターゼを70℃熱処理 DEAEﾝトヨパールイオン交換カラム等により単一精製した．精製酵素の最適温度は100℃以上であり，熱安定性は60分間処理で70℃までほぼ100ｵの残存活性を示した．また，最適pHについてはリン酸緩衝液やブリトンﾝロビンソン広域緩衝液の場合はpH7.0の時が最も活性が高く，トリス塩酸緩衝液の場合はpH9.0が最適であった．pH安定性についてはpH5.0～9.0において安定であった．O-ホスホ-l-ホモセリンに対するKm，Vmaxは，それぞれ0.82mM，2.42U/㎎であった．アポ酵素のホロ化実験により，本酵素活性がPLP に依存していることが明らかとなった．更に本酵素の脱離反応での基質特異性の検討を行った．変異酵素を用いた実験により，stCGSの基質特異性には，活性中心に存在するPhe97を含む領域が深く関わっていることが示唆された．The gene encoding a cystathionine γ-synthase from Sulfolobus tokodaii was cloned and expressed in Escherihia coli Rosetta-gami (DE3). Cystathionine γ-synthase ［EC 2. 5. 1. 48］ from Sulfolobus tokodaii (stCGS) was purified by heat treatment, DEAE- Toyopearl 650M and Sephacryl S-300 column chromatographies from E. coli transformants. stCGS shows optimum activity at pH 7.0, and is stable between pH5.0 and pH9.0. The optimum temperature of stCGS is above 100℃, and the enzyme showed the remaining activity of almost 100% up to 70℃. The K(m) and V(max) with O-phospho-L- homoserine as a substrate are 0.82 mM and 2.42 U/mg. To analyze the role of Phe 97 in the active site of stCGS, we constructed F97Y, R99C, and F97Y-R99C mutant enzymes. Although native stCGS has no activity toward l-methionine, F97Y mutant enzyme gained the elimination activity toward L-methionine.
- 2010-02-01
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