海産性好熱性細菌 Rhodothermus marinus 由来イソアミラーゼの精製，性質検討及びＸ線結晶構造解析
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概要
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Rhodothermus marinus 由来イソアミラーゼ遺伝子を組み込んだプラスミド pBX２を使用し，大腸菌 Top10株を形質転換し，16時間の前培養，24時間の本培養後，菌体破砕し，得られた無細胞抽出液を熱処理（80℃，10 min），50ｵ硫安分画，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（DEAEﾝトヨパール），ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーに供して本酵素の精製を行った．本精製酵素の性質検討を行った結果，本酵素の最適反応温度は70℃，pH４であり，また本酵素は60℃で１時間処理しても活性が低下することが無く，Pseudomonas amyloderamosa 由来イソアミラーゼよりも高い耐熱性を有することが判明した．本酵素の結晶化・X線結晶構造解析を行った結果，本酵素は P. amyloderamosa 由来イソアミラーゼと同様Ｎドメイン・ＡドメインＣドメインの３つのドメインから構成されており，活性残基（Ｄ359，Ｅ395，Ｄ467）など活性中心付近のアミノ酸残基も P. amyloderamosa 由来イソアミラーゼと同様，高度に保存されていた．本酵素の熱安定性が P. amyloderamosa 由来イソアミラーゼよりも高い要因として，P. amyloderamosa 由来イソアミラーゼよりもループの長さが全体的に短いことと，カルシウムイオン結合サイトの欠如が挙げられた．今後さらに構造解析を進めることにより，本酵素の熱安定性機構，反応機構など更なる知見が得られることが期待される．The isoamylase gene from Rhodothermus marinus was cloned into and expressed in Escherichia coliTop 10. As a result of characterization of purified R. marinus isoamylase. the enzyme had an optimumpH of 4.0 and optimum temperature of 70℃. Thermal inactivation studies of the purified R. marinusisoamylase revealed the enzymatic activity to be uninfluenced after one hour incubation at 60℃. Theseresults suggest that R. marinus isoamylase has high thermostability. The crystallization and crystalstructure analysis of R. marinus isoamylase was performed. The three-dimensional structure at 1.9Åresolution was determined in complex with the panose. R. marinus isoamylase is composed of threedomains N, A and C, and, has a (β/α)8-barrel in domain A. The secondary structural alignments of theR. marinus isoamylase and P. amyloderamosa isoamylase was carried out. They have the four active-siteconsensus regions characteristic of the α-amylase family. And the essential residue of the α-amylasefamily (D359, E395, and D467) was conserved in these enzymes. R. marinus isoamylase has shorter loopsthan P. amyloderamosa isoamylase. And R. marinus isoamylase had no Ca2+ binding site. These resultsare thought to be factors of thermostability of R. marinus isoamylase.
著者
-
田村 隆
岡山大院・自然科学
-
今田 勝巳
大阪大学大学院生命機能研究科:科学技術振興機構icorpダイナミックナノマシンプロジェクト
-
今田 勝巳
阪大・院・生命機能・ナノ生体
-
田村 隆
岡山大・大学院・環境生命
-
今田 勝巳
阪大・院理・高分子
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