沃度法ニヨル臟器組織酸化,還元Glutathionノ一定量法ニ就テ

概要

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Zur Bestimmung des Glutathions wurden bis jetzt im allgemeinen die jodmetrische und die kolorimetrische Methode, die auf der Farbenreaktion zwischen der SH-Gruppe und dem Nitroprussidnatrium beruhen, verwendet. Die jodmetrische Methode steht hinsichtlich der Spezifitat ihrer Reaktion der kolorimetrischen Methode nach, dennoch wird erstere in der Hauptsache mehr verwendet als diese, weil die Handhabung bei der jodmetrischen Methode einfacher als bei der anderen Methode ist. Uberblickt man die bisherigen Arbeiten uber das Glutathion, so findet man in den meisten nur das reduzierte Glutathion und nur in einigen wenigen auch das oxydierte Glutathion bestimmt. Dies erklart sich dadurch, dass die Bestimmung des oxydierten Glutathions im Organgewebe nur schwer durchfuhrbar ist und das alsdann erhaltene Resultat ausserdem nicht befriedigend zu sein pflegt. Ich hatte Gelegenheit, die Methode zur Bestimmung des Gehaltes der Gewebe an oxydiertem und reduziertem Glutathion nach Quensel und Wachholder (Hoppe-Seyler's Z. 231, 65 (1935)) nachzuprufen. Leider vermochte ich hierbei aber kein befriedigendes Resultat zu erhalten und uberdies erwies es sich, dass es unmoglich war, das oxydierte Glutathion im Gewebe nach der originalen Methode von Quensel und Wachholder zu bestimmen. Deshalb suchte ich sorgsam nach der Fehlerquelle und modifizierte dann die ursprungliche Methode, wodurch ich denn auch zufriedenstellende Resultate erhielt. Die Ursache fur das Scheitern der Bestimmung des oxydierten Glutathions nach der originalen Methode bildete die Oxydation der Ascorbinsaure. Somit wurde die Selbstoxydation der Ascorbinsaure im sauren Medium, als das reduzierte Glutathion in diesem schon stabil war, noch nicht unterdruckt; sie stieg weiter mit der Zunahme des pH des Mediums parallel an. Bei Vergleich der durch das Gesamtglutathion verbrauchten Jodmenge mit der durch das reduzierte Glutathion verbrauchten Menge in beiden Losungen war, ausser dem genannten Glutathion die Ascorbinsaure enthalten wurde das Vorhandensein einer verschieden grossen Menge Ascorbinsaure in beiden Losungen nicht gestattet. Das pH des Mediums nahm nach und nach dadurch zu, dass Zinkpulver zur Reduzierung des oxydierten Glutathions der mit Sulfosalicylsaure angesauerten Losuug des Organbreies zugesetzt wurde, wobei die Selbstoxydation der in der Losung gleichzeitig vorhandenen Ascorbinsaure ebenfalls im Laufe der Zeit zunimmt. Somit ist es von grosser Wichtigkeit bei der durch den Zusatz des Zinkpulvers bedingten Umwandlung des oxydierten zum reduzierten Glutathion eine Verminderung der Aziditat des Mediums zu verhuten. Ausserdem durfte auch nicht vergessen werden, bei der Bestimmung des Gesamtglutathions sowie des reduzierten Glutathions Temperatur und Zeit gleichzumachen. Ich fuhrte in bezug auf die obengenannte Fehlerquelle, die Umwandlung des oxydierten zum reduzierten Glutathion sowie die Zersetzung oder die Oxydation des Glutathions und der Ascorbinsaure zahlreiche Vorversuche aus und modifizierte die originale Methode wie folgt. 1) Bestimmung der Gesamtglutathions. Das herausgenommene Organ sollte moglichst schnell zu arbeiten beginnen. Eine gewisse Menge (2g) des von Blut befreien Organs, das nach der Herausnahme in Eis gekuhlt worden war, wurde mit Quarzsand und frisch hergestellter 4,4%iger Sulfosalicylsaurelosung im Glasmorser zerrieben, in einen Kolben mit Stopsel getan. Der Glasmorser wurde dann mit derselben Losung ausgespult und insgesamt die dem 9 fachen Volumen des Gewebes entsprechende Menge Sulfosalicylsaurelosung zugesetzt. Darauf wurde 200mg Zinkpulver pro g Gewebe hinzugefugt, die ganzen Mischung in einem Kolben mit dichtem Stopsel stark geschuttelt und im Wasserbad von 33℃ eine Stunde lang stehen gelassen, wahrenddessen man den Kolben wieder 2-3 mal stark schuttelte. Nach Ablauf der Zeit zentrifugierte man das Gemisch und filtrierte die obere klare Losung ab. Dabei war das pH des Filtrates 1,8-2,0. Nachdem das Filtrat 10 Minuten lang im Wasserbad von 20℃ gestanden hatte, nahm man 2ccm davon mit einer Pipette in ein weites Reagenzglas, setzte 3ccm 3%ige Sulfosalicylsaurelosung sowie 2 Tropfen Starkelosung hinzu und direkt vor der Titration noch weiter 1ccm der frisch hergestellten 5%igen Jodkalilosung. Im Anschluss hieran titrierte man das Gemisch mit n/1000 Kaliumjodatlosung, bis sich die Losung uber 30 Sekunden lang schwach blau farbte. Den bei dieser Titration erhaltenen Wert bezeichnete ich mit a. 2) Bestimmung des reduzierten Glutathions. Hierbei wurde das Organ anstatt unter Zusatz von 4,4%iger Sulfosalicylsaurelosung unter Beifugung von 2,2%iger zerrieben. Weiter wurde der Organbreiflussigkeit kein Zinkpulver zugesetzt. Die dann folgende Ausfuhrung war der, eben beschriebenen ganz gleich. Den bei der Titration erhaltenen Wert bezeichnete ich mit b. 3) Die Bestimmung der restreduzierenden Substanzen (in der Hauptsache Ascorbinsaure). Um das Glutathion zu zerstoen, setzte man der unter 2) genannten Organbreiflussigkeit 1ccm 50%iger Formollosung zu. Die weitere Ausfuhrung war der eben beschriebenen ganz gleich. Den bei der Titration erhaltenen Wert bezeichnete ich mit c. Rechnung: 3,26ccm. n/1000 KJO_3=1mg GSH. Hieraus liess sich berechnen dass die verbrauchte n/1000 KJO_3 (ccm)×10×100/(3,26×2)=GSH (mg%) war. Ferner war die Menge des Gesamtglutathions (mg%)=a-c, die Menge des reduzierten Glutathions (mg%)=b-c, die Menge des oxydierten Glutathions (mg%)=a-b.
京都府立医科大学の論文

著者

山本一也
京都府立醫科大學

沃度法ニヨル臟器組織酸化,還元Glutathionノ一定量法ニ就テ

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