7. ブタペプシンの活性中心アスパラギン酸残基を含むペプチド断片の単離とそのアミノ酸配列
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概要
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多くの酸性プロテアーゼはCu^<2+>イオンの存在下にdiazoacetyl-DL-norleucinemethylester(DAN)と化学量論的に反応して,そのプロテアーゼ活性が阻害される。スペーサーを介してDAN基を導入した多孔性ガラスビーズ(CPG)にブタペプシンをCu^<2+>存在下に反応させて固定した。酸変性ヘモグロビンを基質に用いて,ペプシン活性を追跡したところ,3-5h後にはほとんどの活性が消失した。4℃,17h反応させた後,未反応の試薬は充分に洗浄して除き,一部は更に,8M尿素の存在下に0.2Mリン酸緩衝液中,50モル過剰の2-メルカプト三夕ノールで還元し,モノヨード酢酸アミドでアルキル化した。調整したペプシン及びS-CAM-ペプシンは固相に固定したまま,pH2.01緩衝液中でペプシン(0.5-2.0mg/g solid)を用いて,加水分解した。PH4.5の酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液で充分に洗浄した後,ビーズ上のペプチドは0.2M NH_4OHと反応させて(30°,一夜),エステルを切断して切り離した。得られたペプチド画分は0.1%TFAに溶解し(不溶物を除去),HPLCを用いて精製した。単離したペプチド断片のアミノ酸分析,N末端,C末端分析及び手動エドマン分解法でそのアミノ酸配列を決定し,I-V-^<215>D-Tの結果を得た。又,0.2M NH_4OH処理中,α→β転移がみられ,β-転位物もHPLCで単離して配列決定に供した。
- 福岡歯科大学学会の論文
- 2001-12-30
著者
-
黒水 健治
福岡歯大・生化学分野
-
荒木 とみ子
福岡歯大・生化学分野
-
黒水 健治
福歯大・機能生物化学講座生化学分野
-
阿部 興紀
福歯大・機能生物化学講座生化学分野
-
荒木 とみ子
福歯大・機能生物化学講座生化学分野
-
阿部 興紀
福岡歯科大・生化学分野
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